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    數字PCR | 基于EVAGREEN®方法的CRYSTAL數字PCR絕對定量檢測

    儀器信息網 2019/05/20 14:48:05 點擊 161 次

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    基于EVAGREEN®方法的CRYSTAL數字PCR絕對定量檢測

    EvaGreen®是一種無致突變性、無細胞毒性的DNA結合染料,NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統可兼容EvaGreen®染料進行的數字PCR實驗分析。 

    反應體系中游離的的EvaGreen®染料不發出熒光信號,但與雙鏈DNAdsDNA)結合后會發出很強的熒光。NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統使用檢測參比熒光(熒光素鈉鹽)相同的濾光片可進行EvaGreen®染料熒光信號的檢測。 

    使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統,EvaGreen®可以通過使用簡單的引物來實現靶標絕對定量。使用我們的Sapphire芯片、基于EvaGreen®的方法可檢測低至0.2copiesL

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    圖1基于EvaGreen®染料方法的基因組DNA絕對定量


    對未進行片段化的人基因組DNA進行倍比稀釋,濃度范圍從1000-0.2copies/μL,使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統進行絕對定量,使用1.5XEvaGreen®1XPerfeCTa @ UNG Tough mix擴增片段大小為104bpEGFR基因片段。為了保證重復性和穩定性我們進行了三次重復(R2= 0.9977)。在NTC(無模板對照)孔中沒有觀察到陽性微滴。


    EVAGREEN®核酸絕對定量實驗的建立

    當使用EvaGreen®方法進行數字PCR實驗時,需要注意,加入PCR mix的模板dsDNA濃度過高將導致較高的背景熒光。此外,EvaGreen®染料dsDNA具有較高的親和力,但同時也與存在mix中的寡核苷酸有較低的親和力,導致背景熒光的增加。 

    根據您所需定量的DNA類型和數字PCR反應體系,需要預估實際的動態范圍。

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    圖2:EvaGreen®絕對定量散點圖


    對未片段化的人類的基因組DNA進行倍比稀釋后濃度范圍1000-0.2copies/μL,使用NaicaTM Crystal全自動微滴芯片數字PCR儀系統進行絕對定量,使用1.5XEvaGreen®1XPerfeCTa @ UNG Tough mix擴增片段大小為104bpEGFR基因片段。

    灰色點陰性微滴,藍色點陽性微滴。

    RFU:相對熒光強度。


    [來源:CYCLOUD]
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